Liečba EHL koncentrátmi a stanovenie aktivity FVIII: pozor na rozdiely v laboratórnych metódach

Problematikou laboratórneho monitorovania substitučnej terapie pacientov s hemofíliou A, ktorí sú liečení koncentrátmi koagulačného faktora VIII (FVII) s predĺženým biologickým polčasom (EHL), sa na aprílových XV. hemofilických dňoch v Bratislave zaoberala Mgr. Marie Prudková z Oddelenia klinickej hematológie FN Brno. Prednášku Mgr. Prudkovej podporila spoločnosť Takeda. „Stanovenie aktivity FVIII môže byť u týchto pacientov naozaj problematické, lebo medzi jednotlivými laboratórnymi metódami môžeme objaviť diskrepantné výsledky. Súvisí to s tým, že molekula FVIII je u rekombinantných EHL koncentrátov modifikovaná a že máme k dispozícii veľké množstvo reagencií a reagenčných kitov.“

Aktivitu FVIII (FVIII:C) je v súčasnosti možné vyšetriť jednofázovou koagulačnou metódou (one-stage clotting assay, OSA), ktorá je využívaná najčastejšie a je založená na princípe testu APTT, alebo metódou s chromogénnymi substrátmi (chromogenic substrate assay, CSA). „Jednofázovú koagulačnú metódu, ktorá je jednoduchá, lacná a ľahko automatizovateľná, odporúča americká FDA ako referenčnú na stanovenie účinnosti koncentrátov FVIII,“ upozornila Mgr. Prudková s tým, že hlavnou nevýhodou OSA je predovšetkým variabilita dostupných APTT reagencií, a teda aj väčšia medzilaboratórna variabilita výsledkov. Pretože ide o koagulačnú metódu, treba počítať s citlivosťou na protilátky lupus antikoagulans, heparín a priame inhibítory trombínu alebo faktora X. „Je známe, že OSA podhodnocuje aktivitu koagulačného faktora pri podávaní rekombinantných koncentrátov FVIII s odstránenou B doménou. Ďalej, že niektoré reagencie nie sú vhodné pre EHL prípravky a že u niektorých jedincov s ľahkou hemofíliou A naopak nadhodnocujú aktivitu koagulačného faktora,“ upresnila.

Metódu s chromogénnymi substrátmi, ktorá využíva vysoko riedené koncentrácie koagulačných faktorov, naopak odporúča Európska lieková agentúra ako referenčnú nastanovenie účinnosti koncentrátov FVIII. Uvádza sa, že CSA je senzitívnejšia pre nízke koncentrácie FVIII:C (pod 5 %) a že nie je citlivá na lupus antikoagulans. Vďaka tomu, že k dispozícii nie je také široké portfólio reagenčných kitov, CSA  sa prejavuje nižšou medzilaboratórnou variabilitou, ako je to v prípade OSA. „Nevýhodou metódy s chromogénnymi substrátmi je vyššia ekonomická náročnosť a zložitejšia automatizácia,“ dodala Mgr. Prudková s tým, že ojedinele u niektorých pacientov s ľahkou hemofíliou A nadhodnocuje FVIII:C.

OSA, alebo CSA alebo…

Pri výbere vhodnej metódy sa podľa Mgr. Prudkovej môžu laboratóriá oprieť o niekoľko smerníc (guidelines) z roku 2020, napr. United Kingdom Haemophilia Centre Doctors’ Organisation (UKHCDO), French BIMHO group či World Federation of Hemophilia (WFH). Vhodnosť zvolenej metódy by si však mali lokálne laboratóriá overiť. Ako uvádzajú odporúčané postupy UKHCDO, výsledky OSA môžu byť ovplyvnené APTT reagenciou, kalibračným materiálom, deficitnou plazmou, analyzátorom, kalibráciou a dizajnom metodiky, výsledky CSA môžu ovplyvniť rôzne reagenčné kity. „Britské smernice zároveň odporúčajú vybrať metódu, ktorá poskytuje výsledky do 20 % od cieľovej hodnoty u vzoriek s aktivitou FVIII nad 30 IU/dl, respektíve 30 % u vzoriek s aktivitou FVIII v rozpätí 10 – 30 IU/dl,“ vysvetlila.

… čo hovoria smernice?

Následne sa Mgr. Prudková už podrobnejšie venovala meraniu FVIII:C u štyroch EHL koncentrátov – rurioktokogu alfa pegolu, efmoroktokogu alfa, turoktokogu alfa pegolu a damoktokogu alfa pegolu.

Rurioktokog alfa pegol

Ako pripomenula, rurioktokog alfa pegol je rekombinantný FVIII  plnej dĺžky s naviazaným polyetylénglykolom (20 kDa), pričom podľa SPC nie je pre monitorovanie účinnosti určená konkrétna laboratórna metóda. „Výsledky rôznych štúdií sú rozdielne. Dôvody, prečo to tak je, však zatiaľ nie sú celkom jasné,“ komentovala Mgr. Prudková. Podľa britských smerníc UKHCDO je možné použiť tak metódu OSA, ako aj CSA metódu, avšak po lokálnej verifikácii. Odporúčané postupy French BIMHO group hovoria, že terapia rurioktokogom alfa pegolom by mala byť monitorovaná len metódou s chromogénnymi substrátmi, a  WFH žiadne konkrétne odporúčania neuvádza, pretože v literatúre existujú protichodné dôkazy.

Efmoroktokog alfa

Ani u efmoroktokogu alfa, rekombinantného FVIII s odstránenou B doménou naviazaného na Fc doménu ľudského IgG₁, nie je na základe údajov z SPC určená pre stanovenie aktivity FVIII konkrétna metóda,avšak OSA môže byť výrazne ovplyvnená APTT reagenciou a štandardom. Ukazuje sa, že UKHCDO odporúča pre monitorovanie CSA alebo OSA kalibrovanie plazmatickým štandardom so špecifickými reagenciami (Actin FS, Actin FSL, TriniCLOT Auto, Cephascreen, C.K. Prest, Pathromtin SL, STA – PTT A, SynthASil), podobné sú aj odporúčania WFH. Podľa francúzskych smerníc BIMHO group je vhodná len metóda CSA.

Turoktokog alfa pegol

Pokiaľ ide o turoktokog alfa pegol, rekombinantný FVIII so skrátenou B doménou a naviazaným polyetylénglykolom (40 kDa), podľa SPC nie je vhodné použitie OSA s reagenciami na báze oxidu kremičitého, pretože spôsobujú podhodnotenie FVIII:C. Všetky spomínané smernice odporúčajú pre monitorovanie účinnosti FVIII metódu CSA s vybranými diagnostickými setmi (Coatest, Coamatic, FVIII chromogenic – Siemens, Biophen). Metóda OSA sa dá použiť pri kalibráciiplazmatickým štandardom a po lokálnej verifikácii s vybranými reagenciami (Actin, Actin FS, Pathromtin SL, SynthAFax; naopak treba sa vyhnúť APTT-SP, STA – PTT A, TriniCLOT aPTT HS).

Damoktokog alfa pegol

U damoktokogu alfa pegolu, rekombinantného FVIII s odstránenou B doménou a naviazaného na polyetylénglykol (60 kDa), je v SPC uvedené, že sa dá vyšetriť aktivita koagulačného faktora pomocou CSA aj OSA so špecifickými reagenciami. Reagencie na báze oxidu kremičitého môžu opäť podhodnotiť aktivitu FVIII, naopak niektoré reagencie na báze kaolínu môžu viesť k nadhodnoteniu. Zohľadňujú to aj odporúčané postupy UKHCDO a WFH, ktoré pre metódu OSA vymedzujú vhodné reagencie  (Actin FSL, Pathromtin SL, SynthASil), aj nevhodné (Actin FS, C.K. Prest, APTT-SP, STA – PTT A). Uvádzajú tiež, že metóda CSA sa dá pri kalibrácii plazmatickým štandardom použiť s vybranými diagnostickými setmi (Coamatic, Electrachrome, FVIII chromogenic – Siemens). Podľa francúzskych smerníc BIMHO group by sa liečba damoktokogom alfa pegolom mala monitorovať len metódou CSA.

„Všeobecne môžeme povedať, že v prípade koncentrátov efmoroktokogu alfa a rurioktokogu alfa pegolu sa zdá byť monitorovanie aktivity FVIII jednotlivými APTT reagenciami bezproblémové. U turoktokogu alfa pegolu je však nevhodné použitie niektorých reagencií s obsahom kremičitanov, podobne ako u damoktokogu alfa pegolu, pre ktorý navyše nie sú vhodné ani niektoré reagencie s obsahom kaolínu či kyseliny elagovej,“ zhrnula Mgr. Prudková.

… čo hovoria skúsenosti z Brna?

V druhej časti prednášky Mgr. Prudková predstavila výsledky testovania štyroch spomínaných EHL prípravkov na jej pracovisku. Cieľom bolo vyhodnotiť správnosť merania OSA a CSA pomocou in vitro pripravených vzoriek FVIII-deficitnej plazmy s presným množstvom daného koncentrátu – konkrétne 500 UI rurioktokogu alfa pegolu, 250 IU efmoroktokogu alfa, 1 000 IU turoktokogu alfa pegolu a taktiež damoktokogu alfa pegolu. Ďalej pre rurioktokog alfa pegol zostrojiť kalibračnú krivku pomocou štandardu špecifického pre produkt a vyhodnotiť vplyv na výsledky FVIII:C. A nakoniec vyšetriť vzorky pacientov liečených EHL koncentrátmi.

„Pokiaľ ide o metodiku, pre jednorazovú koagulačnú metódu sme použili APTT reagencie Pathromtin SL, Actin FS, Actin FSL, C.K. Prest a Cephascreen. Metódu s chromogénnymi substrátmi u nás štandardne robíme pomocou diagnostického setu Biophen,“ upresnila Mgr. Prudková s tým, že kalibrácia metód prebehla pomocou plazmatických štandardov. Na analýzu boli využité dva prístroje – pre mechanickú detekciu koagula a pre optickú detekciu koagula. Z cieľovej a nameranej FVIII:C bolo vyhodnotené „recovery“ s akceptovateľnou hodnotou ±25 %.

Rurioktokog alfa pegol

Z testovania rurioktokogu alfa pegolu vyplynulo, že najlepšie recovery sa dosiahlo metódou CSA (priemer 92 %), pri použití metódy OSA to bolo s reagenciou Actin FS (priemer 87 %) a C.K. Prest (priemer 84 %). Naopak, najhoršie výsledky boli získané s reagenciami Pathromtin SL (priemer 69 %) a Actin FSL (priemer 61 %). „Ku zlepšeniu recovery u reagencie Pathromtin SL došlo pri kalibrácii štandardom špecifickým pre produkt, konkrétne išlo o priemerné navýšenie na 105 %,“ konštatovala Mgr. Prudková. Pokiaľ ide o výsledky u pacientskych vzoriek, ukázalo sa, že stanovenie aktivity FVIII pomocou metódy OSA s reagenciou Pathromtin SL vychádza podobne ako pri CSA. Relatívny rozdiel predstavoval 7 a 14 % pre vzorky s FVIII:C nad, respektíve pod 10 %.

Efmoroktokog alfa

Ako upozornila Mgr. Prudková, pri testovaní efmoroktokogu alfa bolo pri všetkých použitých metódach pozorované nadhodnotenie FVIII:C. Najlepšie recovery bolo zaznamenané u OSA s reagenciami Cephascreen (priemer 118 %) a Pathromtin SL (priemer 127 %), najhoršie potom s reagenciami Actin FSL (priemer 164 %), C.K. Prest (priemer 139 %) a Actin FS (priemer 140 %) a tiež u CSA (priemer 145 %). Porovnanie výsledkov aktivity FVIII u pacientskych vzoriek vyšlo opäť podobne pre metódu CSA a OSA s reagenciou Pathromtin SL. Relatívny rozdiel predstavoval 9 a 10 % pre vzorky s FVIII:C nad, respektíve pod 10 %.

Turoktokog alfa pegol

Testovanie turoktokogu alfa pegolu preukázalo, že nepriaznivé výsledky recovery bolidosiahnuté len pri použití OSA s reagenciou C.K. Prest (priemer 72 %). U zvyšných reagencií boli hodnoty recovery akceptovateľné – Actin FS (priemer 107 %), Actin FSL (priemer 92 %) a Pathromtin SL (priemer 83 %), rovnako ako u CSA (priemer 118 %). „Avšak u pacientskych vzoriek sme medzi výsledkami jednofázovej koagulačnej metódy a metódy s chromogénnymi substrátmi evidovali výrazné diskrepancie,“ naznačila s tým, že hodnoty pre OSA s reagenciou Pathromtin SL boli nižšie oproti CSA, relatívny rozdiel predstavoval 25 %, respektíve 21 % pre vzorky s FVIII:C nad 20 %, respektíve pod 10 %.

Damoktokog alfa pegol

Pokiaľ ide o testovanie damoktokogu alfa pegolu, najhoršie recovery priniesla metóda OSA s reagenciou Pathromtin SL (priemer 76 %).  Naopak najlepšie výsledky sa dosiahli s reagenciami Cephascreen (priemer 101 %) či C.K. Prest (priemer 111 %) a pri použití CSA (priemer 90 %). „U pacientskych vzoriek s aktivitou FVIII nad 10 % boli výsledky jednofázovej koagulačnej metódy a metódy s chromogénnymi substrátmi podobné. Zaujímavé však bolo, že u vzoriek s aktivitou FVIII pod 10 % viedla OSA s reagenciou Pathromtin SL k nadhodnoteniu výsledkov oproti CSA, pričom relatívny rozdiel dosiahol 74 %,“ poznamenala Mgr. Prudková.

Záverom ešte raz zdôraznila, že vybranú metódu pre stanovenie aktivity FVIII by malo každé laboratórium jednoznačne overiť, pretože výsledná hodnota nie je ovplyvnená len samotnou reagenciou, ale tiež plazmatickým štandardom a analyzátorom.